果樹(shù)苗木無(wú)毒苗的培育

果樹(shù)苗木病毒病多由嫁接傳染，一旦病毒侵入樹(shù)體后，在自 然條件下永遠(yuǎn)保存在樹(shù)體中，無(wú)法消除。根據(jù)果樹(shù)苗木病毒病及 其類病毒病害的侵染、傳播和發(fā)病特點(diǎn)，國(guó)內(nèi)外總的防治策 略是使用無(wú)病毒或抗病毒繁殖材料，嚴(yán)格植物檢疫，清除和 限制侵染源，防治和控制傳毒蟲(chóng)媒。果樹(shù)苗木嫁接繁殖時(shí)，如果 母本樹(shù)帶有病毒，就必然把病毒傳染給新繁殖的苗木。目 前，在栽培的果樹(shù)苗木中，有些品種已全部受病毒侵染，患有病 毒病。為了避免病毒病的危害，就必須清除病樹(shù)中的病毒， 使之無(wú)病毒化，這是果樹(shù)苗木病毒病防治對(duì)策的第一步。

獲得無(wú)病毒母本樹(shù)的方法主要有3種。第一種方法是從 果園中選擇品種純正、多年間樹(shù)勢(shì)健壯、品質(zhì)產(chǎn)量都好的單 株，經(jīng)病毒檢驗(yàn)，確認(rèn)無(wú)病毒后即可獲得母本樹(shù)；第二種方 法是人工培育無(wú)病毒母本樹(shù)，包括通常采用熱處理與莖尖培 養(yǎng)相結(jié)合和莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)培養(yǎng)2種方法；第三種方法是引進(jìn)國(guó) 外無(wú)病毒品種。

果樹(shù)苗木熱處理脫毒，是生產(chǎn)上應(yīng)用最早、最廣泛的一種脫 毒手段。在果樹(shù)苗木生產(chǎn)上，這種技術(shù)已經(jīng)很成熟，已培育出許 多無(wú)病毒果樹(shù)苗木單株。而莖尖組織培養(yǎng)需要精細(xì)的技術(shù)，與熱 處理相比，難度大得多。但是對(duì)于用熱處理不能或難于清除 的病毒，用莖尖培養(yǎng)或熱處理同組織培養(yǎng)相結(jié)合的方法，則 可以獲得無(wú)病毒的個(gè)體。此外，最近開(kāi)發(fā)出的微體嫁接技 術(shù)，已應(yīng)用于獲得無(wú)病毒個(gè)體并引起了人們的廣泛關(guān)注，其主要原理是在無(wú)菌條件下培養(yǎng)的砧木實(shí)生苗上，嫁接莖尖分 生組織，進(jìn)而獲得無(wú)病毒苗。

一、熱處理脫毒

早在100多年前，蘇格蘭的園藝工作者就開(kāi)始利用熱力 治療植物病害。1923年，采用溫湯處理而脫去甘蔗的一種 病毒，成為了在病毒病害中最早脫毒成功的例子。在果樹(shù)苗木方 面，于1936〜1941年間，對(duì)桃叢生病、桃黃化病、偽桃病 等，先后用熱處理，主要是溫湯浸漬法獲得脫毒成功。其中 對(duì)桃叢生病毒，不僅用溫湯而且用高溫空氣處理也獲得成 功。同時(shí)設(shè)計(jì)出一種處理裝置，探索出了熱空氣處理法。即 把空氣溫度調(diào)節(jié)在30~40^0之間，處理一定時(shí)間，以達(dá)到 脫毒的目的。自1950年對(duì)馬鈴薯卷葉病毒用熱處理脫毒取 得成功以來(lái)，到目前為止，除黃化型病毒以外，其他多種病 毒的脫毒也相繼取得成功。常綠果樹(shù)苗木病毒病用熱處理法脫毒 并取得成功的實(shí)例主要有柑橘速衰病毒、柑橘裂皮類病毒、 柑橘脈突病毒、柑橘碎葉病毒等。

熱處理方法有2種，一是溫湯浸漬和高溫蒸汽處理，另 一是高溫空氣處理。

(一）溫湯浸潰和高溫蒸汽處理

通常應(yīng)用的有50〜551處理10~501!^、5^：處理1〜5}1 或35cC處理30〜40h等多種溫時(shí)組合。特別是熱不穩(wěn)定的 病毒類，有些病例在40〜45^：處理5〜301丨11或30^：處理34 即可脫毒。即樹(shù)體的一部分。由于溫湯處理對(duì)植物體的損害 較大，有時(shí)會(huì)導(dǎo)致植物組織窒息或是呈水漬狀，所以在對(duì)果 樹(shù)進(jìn)行熱處理時(shí)，通常只處理接穗；而高溫蒸汽處理，則對(duì) -42 - 植物組織損害較少，因此，現(xiàn)在多用高溫蒸汽處理。在進(jìn)行 熱處理時(shí)，最重要的是要嚴(yán)格控制溫度和處理時(shí)間。

(二）高溫空氣處理

處理的植物體，通常多用盆栽被病毒侵染的整株苗木， 因?yàn)闊崽幚硭�用的病株，其染病組織越小脫毒效果越高。但 剛移栽的苗木根系耐熱性差，一般用移栽后3個(gè)月，最好用 盆栽1年左右的苗木進(jìn)行處理。泥制花盆具有良好的耐熱 性，熱處理中根部溫度將比熱處理溫度下降數(shù)度，因此推薦 用泥制花盆。所以柑橘、蘋(píng)果的熱處理，用無(wú)病毒的實(shí)生砧 芽接帶毒的病穗，芽接1周后開(kāi)始進(jìn)行熱處理，脫毒效果良 好。目前，熱處理裝置有多種，小的只有11^，大的人可以 進(jìn)入內(nèi)部操作，可供大量試材熱處理用。為調(diào)節(jié)濕度，還應(yīng) 安裝加濕器。盡管高溫空氣處理不像溫湯處理那樣，要求病 毒鈍化溫度與植物體能忍受溫度之間相吻合，但溫度及有關(guān) 條件也必須力求精密。

熱處理溫度因病毒種類而異。有的病毒在33〜34尤條 件下即可脫毒，另一些病毒必須在39〜42的條件下，才 能脫毒。生產(chǎn)實(shí)踐中，一般多用35〜381恒溫，尤以381 恒溫的實(shí)例較多。如蘋(píng)果在37尤土1尤恒溫下熱處理28〜 30d,對(duì)褪綠葉斑病毒、莖痘病毒和莖溝病毒的平均脫毒率 為 26. 5%。

許多病例證明，變溫?zé)崽幚磔^恒溫?zé)崽幚淼拿摱拘Ч?/span> 好。近年來(lái)，為了減少高溫對(duì)植物體的損傷，有些病例改為 白天用40〜45^：處理12〜16h,夜間30〜35^：處理8 ~ 12ho

生產(chǎn)實(shí)踐中以白天如^處理^匕，夜間30(^處理8匕的實(shí)例 居多。但也不能一概而論。如柑橘速衰病毒幼苗黃化株系， 在381恒溫條件下處理8周不能脫毒，必須處理12周才能 脫毒；反之，在白天40，夜間30(^的變溫條件下，處理 8周即能脫毒。柑橘碎葉病毒，38^處理16周不能脫毒， 但白天401、夜間301處理6周和白天441、夜間301處 理2周卻脫毒成功。

在進(jìn)行熱處理脫毒時(shí)，還應(yīng)控制好相對(duì)濕度和光照。通 常相對(duì)濕度應(yīng)保持在70^〜80*之間。在過(guò)分干燥的條件 下，熱處理的新梢生長(zhǎng)不良。光以自然光最好，但秋冬期 間，適當(dāng)補(bǔ)充人工光照，對(duì)新梢伸長(zhǎng)有良好作用。而有的病 例用熒光燈和白色燈照明161即可脫毒。

為了提高植物的耐熱性，延長(zhǎng)植物在熱處理中的生存時(shí) 間，熱處理前往往要進(jìn)行預(yù)處理。例如，在用38^：熱處理 前，先在27〜351下處理1〜2周。在植物耐熱性允許的范 圍內(nèi)，熱處理的溫度越高脫毒效果越好，因此，前處理的溫 度也以逐漸由低到高為好。

植物體的耐熱性與植物體各部分組織中的碳水化合物的 含量成正相關(guān)，因此，應(yīng)在植物組織成熟的季節(jié)進(jìn)行 熱處理。

用熱處理脫毒法培育無(wú)病毒個(gè)體時(shí)，通常是剪取苗木在 熱處理中伸長(zhǎng)出的新梢頂端嫩枝，將其嫁接到無(wú)病毒實(shí)生砧 木上。若是用新梢停止生長(zhǎng)的苗進(jìn)行熱處理時(shí)，可剪取已硬 化的枝條，直接嫁接到砧木上。對(duì)于葡萄，剪取熱處理中伸 長(zhǎng)新梢或副梢的頂端部分，長(zhǎng)約1〜5。1，扦插在珍珠巖等 適宜的保濕扦插床中，不久即發(fā)根，一個(gè)月后即可移植。如 果用此法不能獲得無(wú)病毒個(gè)體時(shí)，就必須剪取新梢頂端更短的部分。

二、莖尖培養(yǎng)脫毒

(―)概述

病毒侵入植物體后，一般具有系統(tǒng)侵染性，也即具有全 身擴(kuò)展的特性，但不同的組織和部位，病毒的分布和濃度有 很大差異，甚至有的組織或部位尚無(wú)病毒。植物感染病毒后 不含有病毒的部位，對(duì)病毒的防治具有重要的意義。例如， 大多數(shù)植物的種子不帶病毒，因此可以自然獲得無(wú)病毒后 代。除種子之外生長(zhǎng)點(diǎn)附近，即莖尖和根尖的分生組織也多 不含有病毒。但不含有病毒的部分是極小的，不超過(guò)0. 1〜

0.5mn^這樣小的無(wú)病毒組織，以往無(wú)法繁殖利用。自組織 培養(yǎng)技術(shù)發(fā)展以來(lái)，可以切取這種微小的無(wú)病毒組織，用組 織培養(yǎng)技術(shù)也可培養(yǎng)成完整的植株。如1934年White用感 染煙草花葉病毒的番茄根和1949年Limasset等用感染煙草 花葉病毒的煙草莖分別進(jìn)行的研究結(jié)果表明，病毒濃度呈梯 度變化，病毒粒子隨著植物組織的成熟而增加，頂端組織不 帶病毒。Morel等于1952年從感染花葉病毒和斑萎病毒的植 株上，切取莖尖組織進(jìn)行培養(yǎng)，成功地獲得無(wú)病毒的大麗 花。目前，莖尖培養(yǎng)在草本植物上應(yīng)用較多，而在木本植物 上應(yīng)用甚少。這項(xiàng)技術(shù)在番木瓜、草莓、柑橘和葡萄的脫毒 方面，已獲成功并取得初步應(yīng)用效果。

莖尖培養(yǎng)脫毒程序，一般有以下6個(gè)步驟：第一步，材 料處理和接種；第二步，誘導(dǎo)芽分化和小植株的增殖；第三 步，誘導(dǎo)生根；第四步，生根植株的移栽；第五步，移入苗 :第六步，病毒檢測(cè)。其中分化、增殖、生根3個(gè)步驟，

均需要特殊的培養(yǎng)基。在果樹(shù)苗木莖尖培養(yǎng)中最常使用的是河-

培養(yǎng)基，但各步驟中所需要的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類、用量及 配合比例各不相同，并依培養(yǎng)的果樹(shù)苗木種類而異。脫毒成功機(jī) 率與莖尖大小直接相關(guān)。對(duì)不同的植物，采用大小相同的莖 尖進(jìn)行培養(yǎng)，脫毒效果主要取決于病毒類型而不是植物種 類。正常莖尖培養(yǎng)時(shí)切取的莖尖越小，脫毒率就越高。草莓 切取莖尖為0.2〜0.311^時(shí)，脫毒率為100*;切取莖尖為 1.011^時(shí)，脫毒率僅為50*。但莖尖過(guò)小培養(yǎng)成活率低， 而且操作難度也大。因此，脫毒時(shí)要兼顧脫毒率和成活率， 莖尖切取的大小要適中，一般切取長(zhǎng)度為0.2~0.50^，帶 有1〜2個(gè)葉原基的莖尖作為培養(yǎng)材料。蘋(píng)果切取0. 1〜

0.211^莖尖培養(yǎng)，脫毒株率為35.0^。其中，蘋(píng)果褪綠葉 斑病毒的脫毒株率為80.0^，蘋(píng)果莖痘病毒的為65.0^, 蘋(píng)果莖溝病毒的為50.0^。在未脫除的病毒中，蘋(píng)果褪綠 葉斑病毒占19.19^，蘋(píng)果莖痘病毒占33.3*，蘋(píng)果莖溝病 毒占47. 6%。

(二）莖尖培養(yǎng)脫毒機(jī)制

應(yīng)用電子顯微鏡和熒光抗體技術(shù)可以明顯地看出，在每 一個(gè)“植物-病毒”組合中，都存在一*個(gè)特殊的頂端免疫 區(qū)。這個(gè)頂端免疫區(qū)決定了無(wú)毒莖尖的大小^如果僅最頂端 一個(gè)細(xì)胞不帶病毒，則無(wú)毒簽尖大小為0.1〜0.3^^;如果 免疫區(qū)比較大，則無(wú)毒蓮尖大小為0.5〜3111^然而，即使 在分生組織細(xì)胞中有病毒粒子，培育無(wú)病毒苗也是可能的。 對(duì)此已提出多種解釋，如：正常的或病毒的核蛋白合成之間 的營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)、酚胺抑制劑的存在和因切取莖尖時(shí)細(xì)胞受傷而 引起的代謝破壞。雖然這些假設(shè)中沒(méi)有一種令人十分信服的 解釋，然而，這些假設(shè)卻很好地說(shuō)明了較小的莖尖對(duì)于脫毒是最重要的。

(三）應(yīng)用

莖尖培養(yǎng)獲得的小幼株，可離體培養(yǎng)得到分生單系。要 盡可能快地對(duì)每一個(gè)分生單系的2株或3株小幼株進(jìn)行鑒 定，確定是否還帶病毒。在確定分生單系是否不帶病毒之 前，需多次重復(fù)這些實(shí)驗(yàn)。在有條件的單位，可用酶聯(lián)免疫 吸附檢測(cè)法代替指示植物進(jìn)行這種鑒定。由此而獲得的無(wú)病 毒分生單系，通過(guò)腋生分枝快速繁殖，可在短期內(nèi)給生產(chǎn)單 位提供無(wú)病毒試管苗。

通常情況下，無(wú)病毒苗是保存在黑暗、低溫的條件下， 在此條件下，無(wú)病毒苗可在試管中保存很長(zhǎng)時(shí)間。如木本果 樹(shù)的試驗(yàn)結(jié)果是，切除在繁殖培養(yǎng)基上伸長(zhǎng)生長(zhǎng)莖的所有葉 片，再把莖浸漬在基本培養(yǎng)基中，然后把試管放在冰箱中， 結(jié)果5年后，這些枝條在新鮮培養(yǎng)基上仍能增殖。